컬럼 출구와 이온원 사이에 T자 연결부를 넣고, 분석대상물질과 내부표준 용액을 시린지 펌프로 일정하게 흘려 MRM 기저선을 띄워 둔다. 이 상태에서 용매 블랭크와 블랭크 매트릭스 추출물을 실제 분석 조건으로 주입하면 매트릭스 성분이 나오는 시간대에서 기저선이 내려가거나(억제) 올라간다(증강). 매트릭스 트레이스를 용매 트레이스로 나눈 억제 프로파일에 분석대상물질과 내부표준의 피크 구간을 겹쳐 보고, 어디에 걸리는지에 따라 머무름 조정, 전처리, 분류 밸브 시간, 동위원소 내부표준 가운데 무엇을 바꿀지 정한다. 이 방법은 억제가 생기는 위치를 보는 정성 진단이다. 수정 효과의 크기는 사후첨가 ME%와 매트릭스 로트별 QC로 따로 확인한다.
목차
포스트컬럼 주입법이 알려 주는 것: ME%와의 역할 분담
사후첨가 ME%나 검량선 기울기비는 억제가 얼마나 큰지는 숫자로 알려 주지만, 크로마토그램의 어느 시간대에서 생기는지는 알려 주지 않는다. ME%가 기준을 벗어났을 때 기울기를 바꿀지, 전처리를 바꿀지, 내부표준을 바꿀지 정하려면 억제가 생기는 위치부터 알아야 한다.
포스트컬럼 주입법(post-column infusion)은 이 위치를 찾는 실험이다. Bonfiglio 등(1999)은 이 장치로 혈장 내인성 성분이 ESI 응답을 억제하는 양상을 관찰했다. 그 결과 아세토니트릴 단백질 침전 추출물에서 억제가 가장 컸고, 액-액 추출물에서 가장 작았다. 같은 연구에서는 억제 정도가 화합물마다 달라, 시험한 물질 가운데 극성이 가장 큰 카페인이 가장 강하게 억제되었다. 이 결과는 뒤에서 인퓨전할 물질을 고를 때 근거가 된다.
타르투 대학교의 LC-MS 밸리데이션 교재와 Fu 등(2024)의 리뷰는 모두 이 방법을 억제·증강이 있는지와 어느 구간에서 생기는지를 보는 정성 방법으로 설명하고, 정량값은 주지 않는다고 적고 있다. 따라서 이 글의 절차는 '억제 구간 위치 찾기 → 방법 수정'까지 다루고, 수정 효과의 정량 확인은 Matuszewski 등(2003)이 정리한 사후첨가 매트릭스 팩터(ME%)로 넘긴다. ME% 계산과 허용기준 판정은 이 글에서 다시 설명하지 않는다.
장치 연결: T자 연결부 위치와 분류 밸브 설정
기본 배관은 다음과 같다. LC 컬럼 출구에서 나온 배관을 T자 연결부(tee)의 한쪽 입구에, 시린지 펌프 배관을 다른 쪽 입구에 꽂고, 출구를 이온원으로 보낸다. 이렇게 하면 컬럼 용출액과 인퓨전 용액이 이온원 직전에 섞인다. 질량분석기에 내장 시린지 펌프나 인퓨전 유로가 있으면 그것을 쓰고, 없으면 외부 시린지 펌프를 쓴다. 장비별 피팅 규격과 내장 펌프 설정은 해당 제조사 매뉴얼을 따른다.
연결할 때 확인할 점은 다음과 같다.
– T자 연결부는 사(死)부피가 작은 것을 쓰고, T자에서 이온원까지 배관은 짧게 한다. 이 구간이 길면 피크가 퍼지는 것처럼 억제 구간도 퍼져서 경계가 흐려진다.
– 시린지는 기밀형을 쓰고 기포를 뺀다. 시린지 펌프의 맥동이나 기포는 기저선 물결로 나타나 억제 신호와 헷갈린다.
– 분류 밸브(divert valve)를 쓰는 방법이라면, 진단 런에서는 런 전체 동안 용출액을 이온원으로 보내도록 설정한다. 억제가 자주 생기는 용매 전선(solvent front)과 기울기 끝 세척 구간이 평소 분류 밸브로 버려지는 구간인 경우가 많은데, 이 구간을 보지 못하면 판독이 반쪽이 된다. 이렇게 보면 이온원 오염 부담이 커지므로 진단용 매트릭스 주입 횟수는 필요한 만큼으로 제한한다.
– 분류 밸브가 T자 연결부보다 앞(컬럼 쪽)에 있으면, 밸브가 폐기로 돌아가는 동안 인퓨전 용액만 이온원에 들어가 기저선이 뛴다. 배관 순서를 그림으로 남겨 두면 판독할 때 이런 인공 신호를 걸러낼 수 있다.
인퓨전 용액·농도·유속 정하기
인퓨전 용액에는 분석대상물질과 내부표준을 함께 넣고, 각각을 정량법과 같은 MRM 전이로 모니터링한다. 내부표준 채널을 같이 봐야 분석대상물질과 내부표준이 같은 억제를 받는지 판독할 수 있다. 용매는 이동상과 섞여도 석출되지 않는 조성으로 한다.
유속은 컬럼 유속보다 충분히 작게 잡아, 이온원에 들어가는 용액 조성이 실제 분석 조건에서 크게 벗어나지 않게 한다. 공개 문헌 예를 보면, González 등(2022)은 0.4 mL/min의 LC 흐름에 인퓨전 용액 10 μL/min을 합쳤고, Habler 등(2024)은 0.4 mL/min 흐름에 20 μL/min을 넣었다. 10 μL/min을 400 μL/min에 합치면 인퓨전 용액은 전체 흐름의 약 2.4%(10/410)다. 이 값들은 각 연구의 조건이지 권장 기준이 아니다. 자기 장비의 컬럼 유속과 이온원 허용 유속에 맞춰 정한다.
농도는 숫자 하나로 정하지 말고 시험 주입으로 맞춘다. 기준은 두 가지다. 첫째, 용매 블랭크를 주입하는 동안 MRM 기저선이 잡음보다 충분히 높고 평탄해서 기저선이 내려가는 것을 알아볼 수 있어야 한다. 둘째, 검출기 포화나 자기억제가 생기지 않을 만큼 낮아야 한다. 농도가 너무 높으면 억제가 있어도 신호가 덜 내려간 것처럼 보인다. González 등은 동위원소 표지 화합물 8종을 0.025~0.25 mg/L 범위에서 화합물별로 최적화했고, Habler 등은 타크롤리무스 0.15 ng/mL 용액을 썼다. 화합물과 장비 감도에 따라 이렇게 백 배에서 천 배 이상까지 차이가 나므로, 농도는 실험으로 정해야 한다.
잔류농약처럼 성분이 수백 개인 다성분 분석법은 전 성분을 인퓨전하기 어렵다. 억제 정도가 화합물마다 다르다는 점을 고려해, 머무름시간 구간(초반·중반·후반)과 극성, 이온화 모드(양·음)별로 대표 물질을 골라 혼합 인퓨전한다. 어떤 물질을 왜 골랐는지는 기록에 남긴다.
주입 순서: 용매 블랭크, 매트릭스 로트, 확인용 주입
인퓨전을 시작하고 기저선이 안정된 뒤 다음 순서로 주입한다. 모든 주입은 정량법과 같은 주입 부피, 기울기, 컬럼 온도, 재평형 시간으로 한다. 조건을 바꾸면 그 조건의 억제 프로파일이 아니게 된다.
1. 용매 블랭크(시료 희석 용매): 기준 프로파일이다. 기울기가 진행되면 이동상 조성이 바뀌므로 매트릭스가 없어도 인퓨전 신호가 서서히 오르내린다. 이 변화를 빼야 하므로 반드시 먼저 얻는다.
2. 시약 블랭크(매트릭스 없이 전처리 전 과정을 거친 것): 억제가 전처리 시약·SPE 카트리지·필터에서 나오는지 매트릭스에서 나오는지를 가른다.
3. 블랭크 매트릭스 추출물, 로트별: 생체시료 분석이라면 ICH M10이 매트릭스 효과 확인에 요구하는 로트 구성(가능하면 6개 이상 서로 다른 출처·로트, 그리고 용혈·지질혈증 매트릭스)을 그대로 진단에도 쓰면 뒤의 정량 확인과 로트가 맞물린다. 식품·환경 시료는 신규 매트릭스나 상품군을 추가할 때 해당 매트릭스의 대표 시료로 진행한다.
4. 매트릭스 주입 직후 용매 블랭크: 강하게 머무는 매트릭스 성분이 다음 런까지 넘어와 엉뚱한 시간에 억제를 만드는지 확인한다.
혈장·혈청이라면 같은 런에 인지질 확인용 MRM을 추가하면 억제 구간의 정체를 바로 짐작할 수 있다. Pike와 Kushon(2012)은 인지질을 184→184 전이로 모니터링해, 단백질 침전 시료에서 인퓨전 물질 신호가 크게 떨어진 시간과 인지질 피크가 나온 시간이 겹치는 것을 보였다. 식품·환경 추출물은 공추출물 종류가 다양해 전이 하나로 정체를 찾기 어려우므로, 위치 정보만으로 판단한다.
판독: 용매 트레이스로 나누고 피크 폭 단위로 겹쳐 보기
판독은 세 단계로 한다.
첫째, 매트릭스 주입 트레이스를 같은 시점의 용매 블랭크 트레이스로 나눠 상대 신호(%)를 만든다. 원 트레이스만 보면 기울기 때문에 생긴 기저선 변화를 매트릭스 효과로 오인하기 쉽다. 이 비가 100%보다 낮은 구간은 억제, 높은 구간은 증강이다.
둘째, 분석대상물질과 내부표준의 머무름시간을 피크 정점이 아니라 피크 시작~끝 구간으로 겹친다. 억제 구간의 가장자리는 기울기가 가파르기 때문에, 정점은 깨끗한 쪽에 있어도 피크 꼬리가 억제 구간에 걸릴 수 있다. 중수소 표지 내부표준은 비표지체보다 조금 일찍 나오는 경우가 있으므로, 둘이 억제 구간 경사면에서 서로 다른 신호 수준에 놓이는지도 본다.
셋째, 로트끼리 비교한다. 억제 구간의 위치는 같은데 깊이가 로트마다 다르면 로트 간 변동 문제이고, 특정 로트에서만 새 구간이 생기면 그 로트의 특이 성분(용혈, 지질, 특정 작물 성분 등)을 의심한다.
어느 정도 내려가야 '유의한 억제'로 볼지는 일률적인 기준이 없다. 용매 블랭크 반복 주입에서 얻은 기저선 변동 폭을 바탕으로 판정 규칙을 실험실 SOP에 정해 두고 같은 규칙으로 판독한다.
다음은 가상(교육용) 예시다. 실제 프로파일은 연속 신호이지만 이 예에서는 0.5분 간격 값만 가정했다. 가상 예에서 분석대상물질 A(약 1.0분)는 용매 전선 억제의 꼬리에, 분석대상물질 B(약 4.8분)는 기울기 후반의 깊은 억제 구간에 걸린다. 반면 구조 유사체 내부표준(약 3.0분)은 억제가 거의 없는 구간에 있다. 이런 배치에서는 내부표준이 A와 B가 받는 억제를 보정하지 못한다.
판독 결과에 따른 방법 수정
판독 결과를 어떤 수정으로 연결할지 아래 표에 정리했다. 한 번에 하나씩 바꾸고, 바꿀 때마다 같은 매트릭스 로트로 포스트컬럼 주입 프로파일을 다시 그려 억제 구간과 피크 구간이 실제로 떨어졌는지 확인한다.
| 판독 결과 | 의심되는 원인 | 우선 검토할 수정 | 수정 후 확인할 것 |
|---|---|---|---|
| 피크가 용매 전선 억제 구간에 걸림 | 머무르지 않는 극성 공추출물·염 | 초기 유기용매 비율 낮추기, 머무름이 더 강한 컬럼·이동상으로 머무름 늘리기 | 피크가 억제 구간 밖으로 이동했는지, 분리도 유지 |
| 피크가 기울기 후반·세척 구간 억제에 걸림 | 강하게 머무는 지질·인지질 등 | 인지질 제거·SPE·액-액 추출로 전처리 강화, 기울기 기울기 조정으로 피크를 앞당기기 | 인지질 전이(혈장)·억제 구간 깊이 감소 |
| 매트릭스 주입 다음 용매 블랭크에 억제가 나타남 | 이전 런에서 넘어온 강머무름 성분 | 세척 단계 연장, 재평형 확인 | 다음 런 프로파일이 용매 기준과 겹치는지 |
| 분석대상물질은 억제 구간, 내부표준은 깨끗한 구간 | 머무름이 다른 유사체 내부표준 | 안정동위원소 표지 내부표준으로 교체, 또는 둘이 같은 구간에 오도록 조정 | 분석대상물질·내부표준 채널 프로파일의 형태 일치 |
| 피크가 없는 시간대에 큰 억제·고농도 용출 | 분석과 무관한 매트릭스 덩어리 | 분류 밸브로 해당 시간대를 폐기로 보내 이온원 보호 | 분류 시간 경계가 피크 구간과 충분히 떨어졌는지 |
| 로트 간 억제 깊이 차이가 큼 | 로트 특이 성분 | 전처리 선택성 강화, 진단 로트 추가 | 로트별 프로파일 재현 |
| ESI에서 억제 구간을 피할 수 없음 | 이온화 경쟁 | 대상물질이 이온화된다면 APCI 검토 | 이온원 변경 후 프로파일 재작성 |
분류 밸브 시간은 이 프로파일을 근거로 정하는 것이 가장 직접적이다. 다만 분류 밸브는 이온원을 보호하는 수단이지 피크에 걸린 억제를 없애지는 못한다. 억제가 피크 구간 안에 있으면 분리 조건이나 전처리를 바꿔야 한다. Volmer와 Jessome(2006)은 간섭이 가장 많이 몰리는 곳으로 머무르지 않는 성분이 나오는 용매 전선과, 강하게 머무는 성분이 나오는 기울기 끝을 꼽았고, 분석대상물질의 머무름을 이 두 구간 사이로 옮기라고 권한다. 같은 글은 이온화 기전 차이 때문에 APCI가 ESI보다 억제가 적은 경우가 많다고 설명한다. 다만 이것은 대상물질이 APCI로 충분히 이온화될 때만 쓸 수 있는 선택지다.
수정 후 정량 확인과 밸리데이션 기록
프로파일상 억제 구간과 피크가 떨어졌다고 해서 정량 영향이 사라졌다는 뜻은 아니다. 수정한 방법으로 사후첨가 ME%(매트릭스 팩터, 내부표준 보정 매트릭스 팩터)를 다시 산출해 개선 효과를 숫자로 확인한다. 생체시료 분석법은 ICH M10의 확인 실험까지 거친다. 이 실험은 가능하면 6개 이상 매트릭스 로트(필요하면 용혈·지질혈증 매트릭스 포함)로 저·고농도 QC를 각 3회 이상 분석해, 로트마다 정확도가 공칭값의 ±15% 이내, 정밀도(CV)가 15% 이하인지를 본다. 잔류농약·환경 분석은 해당 분야 지침과 실험실 방법서의 판정 기준을 따른다. 판정 절차 자체는 기존 ME% 판정 글에서 다룬다.
방법 개발·변경 기록에는 '왜 이 조건으로 바꿨는가'를 뒷받침하는 진단 근거가 남아야 한다. 아래 항목을 밸리데이션 기록이나 방법 변경 기록에 첨부한다.
점검표
– [ ] 배관도: 컬럼-T자-분류 밸브-이온원 순서, T자 연결부 종류, 이온원까지 배관 길이
– [ ] 인퓨전 조건: 인퓨전한 물질(분석대상물질·내부표준·대표 물질 선정 이유), 용매, 농도, 유속, 시린지 펌프 종류
– [ ] LC 조건: 컬럼, 기울기, 유속, 주입 부피, 진단 런의 분류 밸브 설정
– [ ] 주입 목록: 용매 블랭크, 시약 블랭크, 매트릭스 로트 식별번호(용혈·지질 포함 여부), 매트릭스 다음 용매 블랭크
– [ ] 판독 결과: 용매 트레이스로 나눈 상대 신호 프로파일, 분석대상물질·내부표준 피크 구간 겹침도, SOP에 정한 판정 규칙
– [ ] 결정: 바꾼 조건과 그 근거가 된 억제 구간, 바꾸지 않은 대안과 그 이유
– [ ] 수정 후 프로파일 재작성 결과
– [ ] 수정 후 사후첨가 ME%와 매트릭스 로트별 QC 결과(정량 확인)
이 진단이 놓치는 것
포스트컬럼 주입 프로파일은 일정 농도의 인퓨전 물질이 받는 억제를 보여 줄 뿐이다. 다음 한계를 알고 해석한다.
– 화합물 의존성: 억제 정도는 화합물마다 다르다. 대표 물질로 그린 프로파일을 다른 성분에 그대로 옮겨 적용하면 틀릴 수 있다. 결정적인 성분은 그 성분 자체를 인퓨전한다.
– 농도 의존성: 인퓨전 농도에서의 억제가 정량하한 부근이나 검량 상단에서도 같다고 보장할 수 없다. 이 차이는 사후첨가 ME%를 농도별로 확인해서 메운다.
– 시료 대표성: 진단에 쓴 블랭크 로트가 실제 시료의 매트릭스 범위를 대표하지 못하면, 운영 중에 새 억제 구간이 나타날 수 있다. 신규 매트릭스를 추가하거나 전처리·컬럼·기울기를 바꿀 때마다 프로파일을 다시 그린다.
– 이온원 상태: 진단 런 자체가 이온원에 매트릭스를 많이 싣는다. 진단 직후 감도가 떨어졌다면 이온원 오염을 먼저 해결한 뒤 프로파일을 해석한다. 이온원 오염 진단은 이 글의 범위가 아니다.
근거 자료
- Fu Y, Li W, Picard F. Bioanalysis (ICH M10 요구사항 인용) (ICH M10(2022) 기준, 리뷰 2024;16(12):631-634) — ICH M10 matrix effect 인용 부분
- Bonfiglio R. et al. The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug compounds. Rapid Commun Mass Spectrom 1999;13(12):1175-1185 (PubMed)
- Matuszewski B.K. et al. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Anal Chem 2003;75(13):3019-30 (PubMed)
- University of Tartu, LC-MS Method Validation course, 5.3 Qualitative estimation of matrix effect
- González O, Dubbelman AC, Hankemeier T. Postcolumn Infusion as a Quality Control Tool for LC-MS-Based Analysis. J Am Soc Mass Spectrom 2022 (PMC)
- Habler K. et al. Standardization via Post Column Infusion—A Novel and Convenient Quantification Approach for LC-MS/MS. Molecules 2024 (PMC)
- Pike E, Kushon S. An Improved Method for Eliminating Ion Suppression and Other Phospholipid-Induced Interferences in Bioanalytical Samples. LCGC 2012
- Volmer DA, Jessome LL. Ion Suppression: A Major Concern in Mass Spectrometry. LCGC 2006
